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🔬 Journal de labo #2 - Trouver les bonnes conditions

Vous vous souvenez dans le dernier épisode (disponible en cliquant ici) quand je disais avoir identifié la cause de mes problèmes ? Et bien je m'étais trompé ! Il se trouve que c'était plutôt un symptôme. Dans cet épisode, après un bref rappel de la situation, je vais expliquer quel est, selon moi et à cet instant T, le problème en réalité (et ce que j'ai mis en place pour le régler).

Les concentrateurs, vraiment le problème ?

Dans l'épisode précédent, j'expliquais que les concentrateurs abîmaient mon complexe protéique. Pour rappel, comme expliqué auparavant, j'essaie de purifier un complexe de protéines d'algue, c'est à dire que j'essaie de l'isoler du reste des protéines et autres composants de cette algue. À la fin de ce processus, j'ai remarqué que mon complexe avait tendance à se dissocier, et je pensais que ce phénomène était dû aux concentrateurs.

Photo d'un tube concentrateur (source)
Principe d'un concentrateur (source)

Cette semaine, j'ai donc réalisé une nouvelle purification, sans utiliser les concentrateurs pour éviter cette dissociation. Malheureusement, j'ai une nouvelle fois obtenu un complexe instable, impossible à utiliser pour la suite de mes expériences. En réalité, et comme souvent pour beaucoup de choses, tout n'est pas tout noir ni tout blanc. Les concentrateurs font partie d'un certain nombre de facteurs très variés, qui peuvent soit stabiliser soit déstabiliser mon complexe protéique. Ça je le savais déjà, mais je pensais qu'en supprimant ce facteur là, cela suffirait éventuellement à purifier de façon stable le complexe. Que nenni ! Les concentrateurs sont certes une source de stress pour les protéines, mais ne pas les utiliser signifie autre chose : je dois trouver un autre moyen afin d'obtenir une solution assez concentrée à la fin de ma purification. J'ai donc décidé cette semaine de simplement utiliser une plus grande quantité d'algue, et donc de purifier plus de protéines.

Pour cela, j'ai dû malgré tout utiliser un concentrateur, mais lors d'une étape moins avancée dans le processus de purification : j'avais espoir que cela serait moins critique pour la protéine. En effet, le complexe était toujours intact après la concentration. Mais au moment de vérifier, à la toute fin de l'expérience, la stabilité du complexe, j'ai à nouveau constaté que l'ensemble des protéines de mon échantillon se sont dissociées.

Du coup, quelle est la vraie cause ?

Dans certains cas, les protéines peuvent aussi précipiter et former des agrégats blancs dans des conditions instables (source)

Et bien comme je l'expliquais plus haut, la réalité est plus complexe que ça. Cette fois-ci et plusieurs fois auparavant, l'ensemble des conditions de purification ont rendu mon complexe instable. Ce qui a changé par rapport à la semaine dernière, ce sont essentiellement deux choses :

  • La quantité de protéines purifiées : j'ai utilisé plus d'algue, ce qui fait que les protéines étaient plus concentrées durant tout le processus. Cela peut provoquer plusieurs phénomènes, et changer le comportement du complexe en solution, qui peut ne pas tenir le choc et se dissocier.

  • Une étape de concentration plus précoce : par la force des choses, j'ai malgré tout dû utiliser un concentrateur, qui n'a de toute évidence pas directement dissocié mon complexe, mais qui a pu contribuer à un changement d'état, provoquant par la suite cette dissociation.

Il faut donc, pour la suite de mes expériences, que je trouve des conditions expérimentales dans lesquelles mon complexe de protéines est suffisamment stable. Énormément de paramètres peuvent modifier cela, mais classiquement en biochimie, on a tendance à se focaliser sur un facteur déterminant : la solution dans laquelle est solubilisée la protéine.

C'est quoi cette solution ?

Principe d'une solution tampon, qui atténue l'effet des ions H+ en interagissant avec eux (source)

Cette solution est souvent appelée "tampon" par abus de langage, alors que ce terme désigne quelque chose de plus spécifique que je vais expliquer dans quelques lignes. Elle est caractérisée notamment par 3 paramètres, que le biochimiste peut faire varier afin de trouver des conditions plus stables pour étudier une protéine. Ces paramètres sont les suivants :

  • Un agent tamponnant, ou plus communément appelé tampon, est un type de molécule qui permet de maintenir le pH d'une solution de façon stable entre deux valeurs seuils. Il s'assure que, lorsque l'environnement de la protéine variera, le pH sera globalement toujours le même et ne changera pas trop (sauf cas particuliers).

  • Des sels, qui interagissent la protéine afin de changer ses interactions avec les autres protéines en solution, mais aussi avec le tampon. Les sels, en fonction de leur concentration, peuvent être parfois bénéfiques ou néfastes pour l'échantillon.

  • Le pH, pour potentiel hydrogène. Cette valeur que la plupart d'entre nous connaît grâce aux piscines, représente la capacité de la solution à fournir des atomes d'hydrogènes ionisés aux molécules en solution. Ce paramètre essentiel peut totalement changer le comportement d'une protéine, en modifiant sa façon d'interagir avec l'environnement (mais d'une façon différente de celle des sels).

Bien sûr, d'autres molécules peuvent être ajoutées afin d'améliorer la stabilité globale de la protéine considérée. Maintenant, comment savoir quel tampon utiliser, quels sels, et quel pH ? Et bien, en essayant ! Car même si évidemment cela n'a rien de magique, l'ensemble des forces d'interactions entre une protéine et sa solution est tellement complexe qu'il est souvent beaucoup plus facile d'essayer plusieurs solutions et de tester leur stabilité ensuite. C'est exactement ce que j'ai fait cette semaine, afin de trouver peut être une solution plus adaptée à mon complexe de protéines.

Essayons !

J'ai donc balayé l'ensemble de ces 3 paramètres, en réalisant une purification en simultané dans les 6 conditions suivantes : tampon HEPES sans sel pH 7.5, tampon HEPES avec NaCl pH 7.5, tampon MES sans sel pH 6.5, tampon MES avec NaCl pH 6.5, tampon Tris sans sel pH 7.5, tampon Tris avec NaCl pH 7.5. De cette façon, je peux tester 3 tampons différents (HEPES, MES et Tris), 2 pH (6.5 et 7.5), et l'effet des sels (avec ou sans NaCl). J'ai inclus ces solutions dès la réalisation de mon gradient de sucrose, afin que le complexe de protéines soit solubilisé dans ces solutions dès le début de son extraction. Voici ce que j'ai obtenu :

Résultats : gradient de densité de sucrose

Sur le gradient de densité de sucrose que j'ai réalisé, on observe de nombreuses bandes colorées. Les protéines sur lesquelles je travaille contiennent des pigments : il est donc facile de les repérer à l'oeil nu durant les expériences. Sur celle-ci, les petites protéines sont en haut du tube, et les plus grosses sont en bas. De plus, le complexe que je cherche a une couleur marron. Je sais où il se situe dans mes conditions initiales (tampon HEPES sans sel pH 7.5) : j'ai donc cherché, dans les autres conditions, une bande marron au même niveau du tube. Voici le résultat :

Gradient de densité de sucrose

Cette expérience est assez simple à interpréter : la bande pointée avec une flèche rouge sur la figure est le complexe de protéines que je recherche. Dans chacune des conditions, on peut voir que cette bande est présente : ce qui signifie que durant le gradient de densité de sucrose, mon complexe est stable dans chaque solution testée (ce qui est une bonne nouvelle !). Maintenant, passons à la suite : la chromatographie d'exclusion.

Résultats : chromatographie d'exclusion

J'ai collecté l'ensemble des bandes correspondant à mon complexe de protéines sur le gradient de densité de sucrose ci-dessus, puis après concentration, je les ai injecté dans la colonne afin d'effectuer une chromatographie d'exclusion. Cette technique permet de séparer les protéines en fonction de leur taille et de leur forme : on obtient des graphiques avec des pics en fonction du volume de sortie de la colonne. Plus la molécule est grosse, plus elle sort tôt. À l'inverse, si elle est petite, elle sortira de la colonne en dernier. Voici les résultats que j'ai obtenu :

Tampon HEPES
Tampon MES
Tampon Tris

On appelle ça une douche froide ! Si vous avez saisi l'essentiel de ce que je vous ai raconté jusqu'à maintenant, vous avez peut-être deviné ce qu'il s'est passé. Sur ces graphiques, chaque pic correspond à une protéine sortant de la colonne. Plus elle sort tôt (c'est à dire plus le volume en abscisse est faible), plus la protéine est grosse. Comme indiqué plus haut, les conditions dans lesquelles j'ai identifié précédemment mon complexe de protéines (ma condition dite "contrôle") est celle dans la solution HEPES pH 7.5, sans sel. Sur l'image correspondant à cette condition, vous voyez un pic majoritaire aux alentours de 11 mL (millilitres) : c'est mon complexe de protéines. Cependant, dans TOUTES les autres conditions que j'ai essayé, et bien ce pic est absent. Au lieu de ça, les graphiques indiquent deux protéines sortant à des volumes inférieurs : 13,5 et 14,5 mL environ pour les conditions sans sel (peu importe le pH et le tampon utilisé), et 15 et 16 mL environ pour les solutions contenant du NaCl (là aussi, indépendamment du pH et du tampon utilisé). Ces protéines sont très probablement les protéines composant mon complexe, mais sous une forme dissociée.

Conclusion de la semaine

Après cette semaine passée à tester différents tampons, pH et sels afin de stabiliser mon complexe de protéines, le verdict est sans appel : parmi toutes les conditions que j'ai essayé, seule la condition initiale (que j'essayais d'améliorer) convient à mon complexe de protéines, et lui donne une relative stabilité, qui n'est cependant pas suffisante pour la suite de mes expériences. Malgré cela, j'ai appris qu'ajouter des sels, changer de tampon ou bien changer de pH provoquait automatiquement sa dissociation. Il faut donc que j'explore d'autres pistes (j'ai déjà plusieurs idées), et je vais m'y atteler dès la semaine prochaine.

C'est tout pour ce journal de labo, deuxième épisode. Merci d'avoir lu, et à bientôt !

Cliquez ici pour accéder à l'épisode suivant


Mots-clés : journal, labo, trouver, conditions, sciences

📅 2024-02-02 par Avatar roms2332


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