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🔬 Journal de labo #3 - Repartir de (presque) zéro

Après les mésaventures de la semaine dernière (disponible en cliquant ici), je suis reparti cette semaine à la recherche de nouvelles conditions afin de rendre mon complexe de protéines stable. Ayant testé de modifier ma solution en faisant varier 3 paramètres clés (tampon, sels, et pH), il me restait quelques options à explorer.

Des dernières pistes à explorer ?

Augmenter la concentration en tampon HEPES (résultats : gradient de densité de sucrose / chromatographie d'exclusion)

La semaine dernière j'ai essayé de nouveaux tampons (Tris et MES), mais je n'ai pas essayé de faire varier la concentration de ma condition initiale (HEPES). Je me disais qu'étant donné que le tampon HEPES semblait convenir à mon complexe, autant en rajouter pour peut-être augmenter sa stabilité ? Voici les résultats :

Gradient de densité de sucrose
Chromatographie d'exclusion à basse concentration d'HEPES
Chromatographie d'exclusion à forte concentration d'HEPES

A gauche, on peut voir le gradient de densité de sucrose. J'ai toujours ma bande au même endroit, ce qui n'est pas réellement surprenant. Sur les deux photos suivantes (au milieu et à droite), j'ai extrait la bande du gradient de densité de sucrose afin de la charger sur ma colonne de chromatographie d'exclusion. L'échelle en ordonnée (OD 280 nm) correspond au signal indiquant qu'une protéine est présente : c'est la densité optique à 280 nanomètres (j'aurai l'occasion de revenir sur ça dans un prochain article, mais gardez à l'esprit que ce signal permet de détecter les protéines). J'ai essayé les conditions habituelles (photo du milieu), ainsi qu'une condition avec 5 fois plus de tampon HEPES (à droite). En biochimie, la concentration en molécules est souvent exprimée en molaire (symbole M), et donc milliMolaire, microMolaire etc. Comme vous le voyez, l'augmentation de concentration du tampon HEPES provoque, elle aussi, la dissociation de mon complexe sur ma colonne, puisque le pic aux alentours de 11 mL disparaît quand j'augmente la concentration de mon tampon. Décidément ! J'avais une dernière idée avant de passer à autre chose...

Et si, dans les nouvelles conditions, le complexe avait changé ? (résultats : gradient de densité de sucrose / chromatographie d'exclusion / gel SDS-PAGE)

La semaine dernière, sur les gradients de densité de sucrose, j'ai pu apercevoir une nouvelle bande qui n'était pas là auparavant. Une des possibilités est que mon complexe a changé de position sur le gradient de densité de sucrose, et en me focalisant sur l'ancienne bande la semaine dernière, je suis peut-être passé à côté de quelque chose. J'ai donc refait la même expérience, en analysant cette fois-ci cette nouvelle bande. Voici ce que j'ai obtenu :

La nouvelle bande sur gradient de densité de sucrose
Chromatographie d'exclusion de la nouvelle bande
Gel SDS-PAGE des deux bandes du gradient de densité de sucrose

L'image de gauche est le gradient de densité de sucrose, sur lequel j'ai indiqué avec une flèche rouge la nouvelle bande que je veux analyser. L'expérience au milieu devrait maintenant vous être familière : il s'agit d'une chromatographie d'exclusion, qui permet de séparer les protéines en fonction de leur taille. Idéalement, comme je cherche un complexe de protéines, j'aimerais avoir un seul pic, aux alentours de 11 mL (spoiler : ça n'est pas du tout le cas ici). L'expérience à droite sur la figure est un gel, comme je vous l'avais montré dans le premier épisode du journal de labo, mais dans des conditions légèrement différentes : ici, au lieu de regarder les complexes de protéines, on regarde les protéines individuellement. C'est donc normal de voir autant de bandes ici dans mon échantillon, car mon complexe contient beaucoup de protéines. Cependant, il y a un problème : ce nouvel échantillon apparu la semaine dernière sur le gradient de densité de sucrose ne contient pas du tout les protéines que je recherche ! C'est donc un double zéro pointé ici : pas de complexe de protéines (il se dissocie sur la colonne), et de toute façon ce complexe ne contient pas les protéines qui m'intéressent. Bon bon bon.....

Bon... on fait quoi ?

Et bien.... je n'ai plus trop d'idées à vrai dire ! Dans ces cas-là, généralement je me tourne vers la littérature, et vers mes collègues/superviseurs afin de comprendre ce qui se passe et d'avoir leur avis. Après discussion avec mon superviseur, je pense que le "complexe" que j'étudie depuis des mois n'existe pas réellement, mais qu'il est plutôt un "artefact". En biologie, lorsqu'on parle d'artefact, cela veut dire que ça n'a pas de sens biologique. En d'autres termes : mon superviseur et moi pensons que ce "complexe" n'en est en réalité pas un, mais s'est formé au cours de la purification. Cette hypothèse explique son apparente petite taille sur le gradient de densité de sucrose, son instabilité, et la difficulté que j'ai à améliorer les conditions permettant de le purifier.

Je n'ai donc à priori plus aucune raison de continuer à étudier ce complexe, ce qui signifie qu'il faut que je trouve de nouvelles conditions dans lesquelles je serai en mesure de purifier un complexe de protéines qui m'intéresse (un vrai, cette fois-ci). Je repars donc à peu près de zéro, et j'ai décidé d'explorer une piste qui, je l'espère, sera un peu plus fructifiante que ce que j'ai fait au cours des derniers mois (c'est pas bien difficile !). Il faut savoir une chose en biologie : globalement, les protéines sont très conservées parmi les êtres vivants. Cela signifie que le complexe de protéines que je recherche est aussi présent chez d'autres algues. En fouillant un peu dans la littérature scientifique, j'ai trouvé deux articles décrivant la structure du complexe d'autres algues. Au delà des résultats de ces études, ce qui m'intéresse moi, c'est surtout la section technique : le matériel et méthodes. Cette section, obligatoire dans tout article scientifique, décrit pas à pas les expériences réalisées par les chercheurs pour arriver aux résultats décrits dans l'article.

Dans cette section, j'ai remarqué que les chercheurs utilisaient une molécule censée stabiliser mon complexe : la bétaine. En fouillant un peu plus profondément ce sujet, j'ai constaté qu'elle est assez largement utilisé par de nombreuses équipes de recherche. J'ai donc décidé d'incorporer cette molécule dans mon protocole de purification, et de voir ce qu'il en est.

Alors peut-être...

Résultats : gradient de densité de sucrose

Je préfère casser le suspens dès maintenant : ça n'a toujours rien donné. J'ai légèrement changé le protocole afin d'inclure la bétaine dès l'étape la plus précoce de purification des thylakoides (les membranes qui contiennent les complexes de protéines qui m'intéressent), mais rien n'y fait : le pattern observé sur le gradient de densité de sucrose n'a pas réellement changé. Voyez par vous-même :

Gradient de densité de sucrose sans et avec bétaine

Résultats : microscopie électronique

Parmi ces résultats plutôt moroses, une lueur d'espoir est malgré tout apparue. J'ai tenté dans un dernier essai un peu vain de regarder au microscope mes thylakoides, afin de voir si le problème ne venait pas encore d'une étape antérieure. Par flemme, j'ai utilisé un tampon contenant très peu de détergent afin de réaliser ma grille de microscopie. Étant donné la concentration du détergent et le temps infime qu'il a passé en solution au contact de mes thylakoides, je pensais qu'il n'y aurait pas de solubilisation. J'ai donc été surpris quand j'ai observé mes grilles de coloration négative au microscope :

Image de thylakoides au microscope électronique
Observation après une très courte solubilisation des thylakoides

À gauche, on voit les thylakoides non dilués par mon tampon. On voit bien ces formes membranaires, qui ne sont donc pas encore solubilisées par le détergent puisque mon tampon n'en contient pas. Cette photo confirme, à priori, que mes thylakoides ont l'apparence attendue et que normalement, tout va bien jusqu'à cette étape. À droite, j'ai dilué ces mêmes thylakoides avec du tampon contenant un tout petit peu de détergent (désolé pour la photo floue, j'ai eu beaucoup de mal à régler le focus). Le résultat est spectaculaire : je n'observe pratiquement plus aucune membrane, mais bel et bien des particules, ayant au passage de jolies formes. Cette expérience indique qu'il suffit d'un peu de détergent, durant très peu de temps, pour que l'essentiel de mes thylakoides soient solubilisés, et que les complexes de protéines qui m'intéressent apparaissent. Maintenant, il faut les purifier, et ça c'est une autre histoire !

Conclusion de la semaine

Globalement, ma semaine n'a rien donné, mais a au moins eu le mérite d'exclure un bon nombre de pistes. J'ai cependant obtenu un résultat encourageant en fin de semaine, qui indique que visiblement, mes thylakoides sont très très fragiles. Une des possibilités est qu'à haute concentration, la solubilisation par le détergent s'effectue de façon... disons étrange, et que cela explique toutes les difficultés que j'ai eu jusqu'à maintenant (je l'espère). La semaine prochaine, je vais partir de ce résultat afin d'explorer d'autres pistes.

Merci d'avoir lu, et à bientôt !

Cliquez ici pour accéder à l'épisode suivant


Mots-clés : journal, labo, sciences, repartir, zéro

📅 2024-02-15 par Avatar roms2332


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