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🔬 Journal de labo #4 - Pourquoi s'embêter à purifier ?

Après avoir exploré de nombreuses pistes les semaines précédentes, je n'ai pas pu extraire un complexe de protéines stable à partir de mon algue (cliquez ici pour accéder à l'épisode précédent). A partir de ce moment là, j'ai donc essayé de nouvelles approches afin de pouvoir avancer, et j'ai du pour cela voir les choses sous un tout nouvel angle.

Quelques explications sur ce changement d'approche

Est-ce absolument nécessaire de purifier ce complexe ?

Et bien dans l'immense majorité des cas, oui. Pour étudier une protéine en biochimie, il est nécessaire de l'isoler, principalement car les techniques permettant d'obtenir des informations sur les protéines mesurent un signal global sur l'échantillon. Par exemple, si je souhaite mesurer le signal de fluorescence de ma protéine, je le mesure en réalité sur l'échantillon. Ainsi, si cet échantillon contient d'autres composants (d'autres protéines, ou d'autres molécules fluorescentes), il sera la plupart du temps impossible ou très difficile de différencier le signal émis par la protéine d'intérêt du signal émis par les contaminants. Il en va de même pour la RMN, la cristallographie, la microcalorimétrie etc.

Est-ce le cas pour la microscopie électronique ?

La réponse est oui, mais elle est beaucoup moins évidente ! La microscopie électronique est peut être la technique de résolution de structure la plus permissive en ce qui concerne la pureté de l'échantillon, du moins dans certains cas. Pourquoi ? Car le principe même de cette technique est de prendre en photo les particules présentes dans l'échantillon, et de les sélectionner une à une afin de reconstruire l'image en 3D de la protéine qui nous intéresse. Pour travailler sur un échantillon impur, il "suffit" donc de sélectionner uniquement les particules qui nous intéressent, et d'ignorer les contaminants !

Grille de microscopie observée la semaine dernière, sur laquelle on peut observer des particules de tailles variées.

Regardez ci dessus sur cette photo prise la semaine dernière. J'ai de nombreuses particules sur mon micrographe, certaines étant petites et certaines étant plus grosses. Je connais approximativement les dimensions du complexe de protéines que je recherche, je peux donc exclure tout de suite les objets très petits de ma sélection.

Alors c'est bon ?

Oui et non ! Il y a beaucoup de choses à vérifier et à faire avant de se lancer dans une analyse aussi compliquée. Même si je ne peux pas purifier mon échantillon proprement, je peux au moins savoir ce qu'il y a dedans. Je me suis donc lancé cette semaine dans des expériences ayant 2 buts principaux : reproduire ce que j'ai obtenu la semaine dernière sur cet échantillon observé au microscope qui m'a donné espoir (pour être sûr que je tiens réellement une piste), et obtenir le maximum d'informations à son sujet. C'est parti !

Au boulot !

Reproduire l'expérience de la semaine passée (résultats : microscopie électronique)

La semaine dernière, j'avais décidé de regarder directement les thylakoides de mon algue au microscope, afin de savoir si, dès cette étape là, il y avait un problème. Par flemme, j'ai utilisé un tampon contenant très peu de détergent. J'ai été très surpris en voyant de nombreuses particules au microscope, car je m'attendais à voir des structures subcellulaires de grande taille. J'ai donc essayé de reproduire cette expérience, en rajoutant des quantités croissantes de détergent à mes thylakoides, puis je les ai observé par microscopie. Voici ce que j'ai obtenu :

Thylakoides observés au microscope électronique avec différentes concentrations de détergent.

On voit très clairement, sur les photos, l'effet du détergent sur les thylakoides. A faible pourcentage, on peut encore observer les structures membranaires des thylakoides. Puis plus la concentration en détergent augmente, plus on voit des particules, qui constituent la majorité de l'échantillon quand j'ai rajouté suffisamment de détergent (ici 5%). J'ai donc bien réussi à reproduire ce que j'ai obtenu la semaine dernière, donc la première étape est un succès !

Quelles sont ces particules ? (résultats : électrophorèse CN-PAGE / 2D-PAGE)

Suite à ça, j'ai réalisé une électrophorèse un peu particulière, et assez compliquée (j'ai récemment écrit un article au sujet de cette technique, qui est disponible ici). J'ai d'abord lancé un gel CN-PAGE (pour Clear Native PAGE, c'est à dire sans colorant) : il permet de mettre en évidence la présence de complexes de protéines dans mon échantillon. Ensuite, j'ai découpé cette bande de gel, et je l'ai analysé dans une seconde dimension : de cette façon, j'analyse le contenu en protéine de chaque complexe de protéines, de façon séparée. Voici ce que ça donne :

Gel CN-PAGE des thylakoides solubilisés, avec deux marqueurs de poids moléculaire comme référence.

Sur le premier gel appelé CN-PAGE, on voit plusieurs bandes vertes et marrons : cette couleur s'explique par la présence de pigments dans ces complexes protéiques. La première chose relativement surprenante est que malgré le fait que l'échantillon n'ait pas été purifié, il n'y a seulement que quelques complexes de protéines contenant des pigments, ce qui est une bonne nouvelle ! Cela veut dire que par microscopie, je n'aurai pas énormément de particules différentes à analyser. La bande verte correspond à un complexe de protéines qui m'intéresse : j'ai donc découpé toute cette "colonne" de mon gel, afin de l'analyser sur un second gel 2D-PAGE, ci dessous :

Gel 2D-PAGE de la bande précédemment obtenue et découpée sur le gel CN-PAGE, avec des marqueurs de poids moléculaire à droite.

Ce gel permet de connaître le contenu en protéines de chaque complexe précédemment observé sur le gel CN-PAGE. Il se lit de façon verticale, et correspond directement avec la piste du gel CN-PAGE : si des tâches bleues apparaissent dans une colonne où il y avait des tâches vertes ou marrons sur le gel CN-PAGE, ces tâches sont les protéines qui constituent ce complexe. Dans cette expérience, le gel 2D-PAGE révèle que le complexe apparu en vert sur le premier gel contient des protéines qui correspondent à ce que je recherche car les tailles correspondent avec ce à quoi je m'attendais.

Et donc c'est bon non ? C'est quoi la suite ?

Effectivement c'est plutôt bon ! Je vous ai fait la version simplifiée car j'ai dû effectuer toute une série de contrôles afin de m'assurer que mon échantillon est prêt pour l'analyser par cryo-microscopie électronique, mais actuellement j'attends de pouvoir l'observer sur le microscope le plus puissant de mon laboratoire. Il y a une chose importante à savoir : quand je parle de microscopie électronique, cela signifie que je regarde les particules de mon échantillon afin d'en connaître son contenu (un peu comme un contrôle qualité avant l'analyse finale). Cependant, quand je parle de cryo-microscopie électronique, c'est très différent : cette technique permet de collecter un nombre très important d'images, une fois que l'on a un échantillon propre, afin de résoudre la structure 3D d'un complexe de protéines ou d'une protéine d'intérêt (ce qui représente le but final de mes recherches). Ces deux types d'observations s'effectuent sur 2 microscopes différents, et j'attends actuellement de pouvoir accéder au microscopie permettant l'analyse par cryo-microscopie électronique.

La nature exacte du complexe m'est cependant encore inconnue, mais avec l'aide de mes collègues qui ont plus d'expérience que moi sur ce sujet, je serai peut être (du moins je l'espère) en mesure de sélectionner les bonnes particules et de reconstruire une structure de ce complexe. Le gros point positif dans tout ça, c'est le fait que j'ai pu reproduire mon expérience de la semaine dernière, et que l'analyse sur gel est cohérente avec les photos que j'ai obtenu au microscope cette semaine. Maintenant, il n'y a plus qu'à croiser les doigts, et espérer que ce complexe en soit vraiment un (et que les grilles de cryo-microscopie électronique soient belles) !

C'est tout pour cette semaine, merci d'avoir lu ! On se retrouve très bientôt pour, je l'espère, un journal de labo un peu plus centré sur la cryo-microscopie électronique, c'est à dire la technique permettant d'obtenir des structures de protéines en 3D. A bientôt !

Cliquez ici pour accéder à l'épisode suivant


Mots-clés : journal, labo, pourquoi, embêter, purifier, sciences

📅 2024-03-02 par Avatar roms2332


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