🔬 Journal de labo #6 - Enfin les cartes de densité électronique !

Ca faisait longtemps ! C'est le moins que l'on puisse dire. Les raisons à ce manque de contenu sont diverses, mais plutôt positives : j'ai été beaucoup occupé par mon travail, par nos visites à Nina et moi, mais aussi par mes récentes acquisitions (une New 3DS XL japonaise). Roms Land est un projet à long terme, dans lequel je m'investirai de temps à autre, et il est très probable que ce genre de "coupures" se reproduise. Ceci étant dit, rentrons dans le vif du sujet !

Depuis le dernier épisode du journal de labo (disponible ici), il y a eu BEAUCOUP de nouveau, et pratiquement que du positif. La dernière fois, j'expliquais que j'avais à priori réussi à purifier de façon stable mon complexe de protéines, et j'avais raison. La première bonne nouvelle, c'est que j'ai en effet pu prendre un tas de photos de ce complexe par microscopie électronique, et déterminer en partie sa structure. La seconde bonne nouvelle, c'est que durant les mois qui ont suivi, j'ai pu purifier aussi un second complexe de protéines de façon stable, et obtenir sa structure également. En quelques mois donc, j'ai énormément avancé sur la partie expérimentale, et je me focalise maintenant plutôt sur la partie analyse (qui est au moins tout aussi intéressante). Cet article est l'occasion pour moi de vous expliquer en quoi consiste cette analyse des images de microscopie, et comment on obtient, à la fin, la structure du complexe de protéines.

Qu'est-ce qu'on fait avec toutes ces photos ?

C'est la première question qui vient : à quoi servent toutes ces photos ? Car oui, on parle d'une quantité de photos très importante. Ici, j'ai pu obtenir plus de 10 terabits de photos à très haute résolution, sur lesquelles on voit des particules. Dans un premier temps, le but de l'analyse est d'identifier les différentes particules sur chaque photo. Vous vous doutez bien que non, je ne vais pas ouvrir chaque photo sur Paint et découper la zone où j'observe une particule. Il existe des logiciels puissants qui permettent d'analyser ces photos de façon semi-automatisée : l'objectif est donc de trouver les bons paramètres dans ces logiciels pour extraire un maximum de particules.

Afin d'extraire ces particules, il faut d'abord réaliser un traitement sur chaque image (je ne vais pas rentrer dans les détails de cette étape là que je ne maitrise pas moi-même). Une fois les images traitées, on effectue ce qu'on appelle un picking manuel. Sur chaque image, on va sélectionner à la main différentes particules qui ont une forme et une taille qui correspondent au complexe de protéines. C'est aussi lors de cette étape que l'on définit les dimensions de la "boîte" d'extraction que va utiliser le logiciel. Dans un second temps, on regroupe les images qui se ressemblent afin d'obtenir une image "moyenne" de ces particules : on appelle ça des classes 2D. Ces classes d'images représentent les différentes "vues" du complexe de protéines sur la grille de microscopie.

Une fois que l'on a obtenu les classes 2D, on effectue un picking automatique. Sur la base des classes 2D précédemment obtenues, le logiciel va explorer toutes les images et sélectionner des particules qui ressemblent à ces classes. Cela permet d'éviter de sélectionner TOUTES les particules à la main sur l'ensemble des images, pratique hein ? Ensuite, on recalcule les classes 2D pour l'ensemble des images, et on obtient ce genre de résultat :

Chaque photo est en réalité un groupe d'images, et représente un certain type de particule avec un certain type d'orientation. Nous avons donc désormais une vue du complexe de protéines, mais en 2D uniquement. La prochaine étape : calculer la vue en 3D !

Comment passer de la vue 2D à la vue 3D ?

A ce stade là, nous avons fait le plus compliqué. En effet, l'étape la plus importante est la sélection des particules. La qualité de la structure que nous allons obtenir dépend entièrement des particules sélectionnées : il est donc primordial de sélectionner les "bonnes" particules, c'est à dire celles qui sont réellement notre complexe de protéines. Car oui, en réalité sur la grille de microscopie, il y a plein de formes diverses et variées, et il est parfois difficile de distinguer ce qui est une particule et ce qui n'en est pas. Si la grille n'a pas été réalisée parfaitement, la glace forme des dépots noirs sur les images, ce qui rend l'analyse compliquée. Aussi, les micrographes contiennent des particules plus petites, plus grosses, qui sont des formes agrégées et/ou dissociées du complexe de protéines que je recherche. Vous l'avez compris : il faut passer beaucoup de temps à regarder les images pour bien sélectionner les bonnes particules.

Une fois cette étape passée, nous allons calculer une vue 3D à partir des particules minutieusement sélectionnées. En effet, chaque particule a une orientation légèrement différente des autres, ce qui veut dire qu'en prenant l'ensemble des particules, on peut reconstruire une vue 3D du complexe de protéines grâce à ces différents "points de vue". Voici à quoi ressemble typiquement une première enveloppe 3D obtenue par microscopie cryo-électronique :

Ce que vous voyez est une carte de densité électronique. En réalité, c'est le nuage d'électrons qui constitue le complexe de protéines. Cela semble grossier aux premiers abords, mais grâce aux étapes suivantes, cette carte sera améliorée, jusqu'à un point où il sera possible parfois de distinguer chaque atome de chaque protéine. On appelle ceci l'affinement, et c'est la dernière étape du processus de traitement des images de microscopie cryo-électronique. Je vais passer sur cette étape-là car elle est très complexe, mais voici un comparatif de plusieurs cartes d'électrons au cours de l'affinement pour que vous vous rendiez compte :

La dernière étape est la résolution de la structure !

Où est la structure dans tout ça ?

La résolution de structure est simple sur le principe, mais plus compliquée dans les faits. Le but de ce processus est d'insérer, dans la carte de densité électronique, les atomes correspondant au complexe de protéines (cette suite d'atomes est appelée séquence de protéine). Pour réaliser cela, on utilise généralement une structure similaire à celle que l'on veut obtenir, et on "cale" cette structure dans la carte de densité électronique. Voyez ce que ça donne :

Cela semble juste aux premiers abords, mais les protéines constituant le complexe sur lequel je travaille n'ont pas exactement la même séquence que le modèle que j'ai utilisé. Ainsi, il faut dans un premier temps remplacer TOUS les atomes de ce modèle par les atomes de mon complexe de protéine. Cette étape peut être automatisée afin d'obtenir un premier résultat plutôt faux, mais duquel je peux partir pour ajuster à la main chaque atome ou groupe d'atomes. Une fois que les séquences de protéines rentrent parfaitement (ou presque) dans la carte de densité électronique, ça y est : la structure est résolue.

Voilà, vous connaissez maintenant la finalité de mes recherches et ce sur quoi je suis en train de travailler actuellement. Pour en revenir à nos moutons, j'ai obtenu une carte de densité électronique pour deux complexes de protéines actuellement, et j'essaie de caler mes séquences de protéines à l'intérieur de ces cartes. Cela prend beaucoup de temps, et j'aurai l'occasion de revenir sur les difficultés que je rencontre pour y parvenir. C'est tout pour aujourd'hui ! On se retrouve dans quelques temps (pas très risqué de dire ça) pour un nouvel épisode, probablement aussi centré sur les structures de protéines.

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