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🔬 Journal de labo #5 - un complexe sauvage apparaît

Re-bonjour, ça faisait un petit moment ! Il s'en est passé des choses ces dernières semaines. Dans le dernier épisode du journal de labo (disponible en cliquant ici), je découvrais que finalement, il n'était pas spécialement nécessaire de purifier mon échantillon afin d'observer des complexes de protéines par microscopie. Comme souvent, je pensais avoir raison, mais finalement... pas vraiment. Durant ces dernières semaines, j'ai en réalité peaufiné mon protocole de purification, et j'ai pu enfin isoler un complexe de protéines et l'observer par cryo-microscopie électronique. Je vous explique tout ça, et la suite de mes manips !

On purifie finalement ou pas alors ?

La purification de mon complexe de protéines est plutôt compliquée, et me donne du fil à retordre. Depuis le début de cette série d'articles de journal de labo, cela reste mon principal problème, et il y a toujours une étape où les choses ne sont plus cohérentes, et deviennent compliquées à expliquer. Comme je le disais la semaine dernière, il est envisageable de ne pas purifier l'échantillon, et de sélectionner uniquement les particules qui m'intéressent sur les photos de microscopie. Je partais donc pour faire ça, mais cela entraîne plusieurs problèmes, notamment ceux-ci :

  • La sélection des particules est compliquée, et demande une vraie expertise, que je n'ai pas (encore). Sur une photo de microscopie, les protéines sont présentes sous différentes orientations. Par conséquent, certaines orientations de mon complexe de protéines peuvent ressembler à des orientations de protéines contaminantes, ce qui rend la tâche très compliquée.

  • Le fait d'avoir des contaminants empêche d'augmenter la concentration de l'échantillon. Si, par exemple, mon échantillon contient très peu de complexes de protéines, il est nécessaire que j'augmente sa concentration. Cependant, en effectuant ce processus, les contaminants vont également être plus présents, ce qui va encore complexifier la sélection des particules.

Ces deux raisons m'ont poussé à m'entêter encore un peu, et à essayer une nouvelle fois de purifier mon échantillon. Pour être totalement transparent, j'ai tenté de ne pas purifier, et j'avais du temps libre avant de passer mes échantillons au microscope, ce qui m'a poussé à essayer une nouvelle méthode de purification : la chromatographie échangeuse d'ions.

La chromatographie échangeuse de quoi ?

Principe d'une chromatographie échangeuse d'ions. Sur cette expérience, les ions négatifs (i- sur le schéma) vont chasser les protéines chargées négativement (boules jaunes) qui s'étaient fixées sur la résine (boules positives)(source)

Normalement, le terme chromatographie vous est familier. Jusqu'à maintenant, comme expliqué dans les précédents épisodes, j'utilisais la chromatographie d'exclusion pour purifier mon échantillon. Ici, le type de support est le même, mais la méthode de séparation des molécules est différente. Lors de la chromatographie d'exclusion, je séparais les protéines en fonction de leur taille. La chromatographie échangeuse d'ions, elle, permet de séparer les protéines en fonction de leurs charges (positives ou négatives). Les protéines, dans l'immense majorité des cas, ont des charges négatives et positives à leur surface : comme vous vous en doutez, le positif attire le négatif, et inversement. La chromatographie échangeuse d'ions se base sur ce principe, et consiste à retenir les protéines sur une résine chargée négativement ou positivement (dans mon cas, positivement). Après avoir fixé les protéines, on fait passer sur la colonne des petites molécules chargées (par exemple, des sels) qui vont progressivement remplacer les protéines sur la résine et les faire tomber : ainsi, cette technique permet de séparer les protéines en fonction de leur capacité à rester "collées" à cette résine. Plus elles sont chargées, plus elles restent collées.

Bon... essayons !

Résultats : chromatographie échangeuse d'ions

Dans mon cas, j'ai d'abord effecté un gradient de densité de sucrose, et passé la fraction qui m'intéressait sur cette colonne. Voici les résultats :

Gradient de densité de sucrose (gauche) et chromatographie échangeuse d'ions (droite)

Sur le gradient de densité de sucrose (à gauche ci-dessus), je me suis focalisé sur la bande verte très intense, qui pourrait peut-être contenir des complexes de protéines. La seconde photo (à droite) est le profil de la chromatographie échangeuse d'ions. On peut voir, comme pour la chromatographie d'exclusion, plusieurs pics, en fonction du volume de tampon écoulé au travers de la colonne. Etant donné que le gradient de densité de sucrose a déjà exclu quelques contaminants, j'ai pris le pari de sélectionner uniquement le pic majoritaire, et d'espérer qu'il contienne un complexe de protéines (je n'en avais aucune idée cela dit). Il y a plusieurs autres pics, qui peuvent eux aussi contenir des complexes de protéines, mais cela aurait pris plus de temps et aurait pu causer la dégradation de mes échantillons.

Résultats : électrophorèse CN-PAGE/2D-PAGE

Pour voir si ce pic contient un complexe de protéines, j'ai effectué un gel CN-PAGE, comme lors de l'épisode précédent. Voici ce que j'ai obtenu :

Gels CN-PAGE (gauche) et 2D-PAGE (droite)

L'expérience indique clairement qu'un complexe de protéines est présent, ce qui est une bonne nouvelle ! En plus de ça, et c'est encore mieux : il a l'air pur, car il y a une seule bande sur toute la piste du gel. Pour savoir ce qu'il contient, j'ai réalisé, comme lors de l'épisode précédent, un gel 2D-PAGE. Pour rappel, cette technique permet de savoir quelles protéines constituent individuellement mon complexe de protéines. J'ai continué mon expérience en réalisant un gel 2D-PAGE, visible sur la droite de la figure ci-dessus. L'expérience révèle qu'il y a quelques contaminants (qui ne sont pas visible sur le gel CN-PAGE, car il ne contiennent pas de pigments), mais que globalement, l'échantillon est plutôt propre. La composition en protéines de mon complexe correspond à ce à quoi je m'attendais, je peux donc passer à la suite et essayer d'observer mon échantillon par microscopie électronique !

Résultats : microscopie électronique / cryo-microscopie électronique

Photo de microscopie électronique

Sur les grilles de microscopie électronique ci-dessus, on observe de longues formes de plusieurs dizaines de nanomètres, ce qui indique définitivement que ce complexe est observable par microscopie, donc bonne nouvelle ! Cela dit, il reste encore une étape essentielle : réaliser une cryo-grille, et observer cet échantillon par cryo-microscopie électronique. En effet, le microscope électronique "classique" permet de visualiser l'échantillon, mais n'est pas assez puissant pour obtenir un niveau de détails suffisant pour résoudre la structure du complexe de protéines. Pour surpasser cette limitation, j'utilise un microscope plus puissant, qui analyse des échantillons déposés sur des grilles qui sont ensuite plongées dans l'éthane liquide (qui est très très froid !). Voici ce que j'ai obtenu :

Photo de microscopie électronique sur cryo-grille

Sur ces images, on voit moins de particules, mais leur taille est plutôt conséquente : le complexe est donc bien stable et supporte le trempage dans l'éthane liquide ! Tout est bon, maintenant je n'ai "plus qu'à" traiter ces images afin de reconstruire la structure 3D de ce complexe, et de voir comment les protéines s'imbriquent entre elles. Ca sera pour un autre journal de labo (plusieurs même), car c'est un gros morceau.

Merci d'avoir lu, n'hésitez pas à commenter si vous avez des remarques ou questions, et à bientôt !


Mots-clés : journal, labo, complexe, sauvage, apparait

📅 2024-03-22 par Avatar roms2332


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