🔬 Journal de labo #1 - Satanés concentrateurs !

Cette semaine au laboratoire, j'ai pu avancer sur un problème qui me préoccupait depuis plusieurs semaines, voire même des mois. Mais avant de vous expliquer le pourquoi du comment, je vais essayer d'introduire quelques notions pour tenter de mieux me faire comprendre.

Tout d'abord, quelques notions sur la purification des protéines

Les protéines, kézako ?

Sans aucun doute le point le plus important de mes recherches. En attendant un ou plusieurs articles plus complets et plus détaillés sur les protéines, parlons ici de généralités importantes pour la suite du journal de labo.

Les protéines sont des molécules composées d'unités de base, appelées d'acides aminés. Elles sont essentielles pour la totalité des êtres vivants, car elles assurent un très grand nombre de réactions à l'origine de nombreux processus biologiques clés comme la division cellulaire, la transmission de signaux entre neurones, ou encore la réplication de l'ADN. Vous l'aurez donc compris : en étudiant les protéines, on comprend comment fonctionnent ces processus à l'échelle moléculaire.

C'est donc ce que je fais actuellement au Japon, j'étudie une protéine d'algue, enfin plus précisément un complexe de protéines d'algue. Mais pour les étudier, il faut d'abord les isoler. Imaginez-vous regarder une plante à l'oeil nu, et la voir pousser ou faner : il est impossible de dire quelle est la cause de ce phénomène, tant la plante contient des milliards de molécules différentes qui s'articulent entre elles. L'ensemble des processus permettant d'isoler une protéine est appelé "purification".

Comment purifier une protéine ?

Vaste question ! En effet, tout dépend de la protéine considérée. Comme expliqué ci-dessus, les acides aminés composent les protéines. Étant donné qu'il en existe 20 différents, et qu'une protéine est souvent constituée de plusieurs centaines d'acides aminés, vous imaginez bien que les combinaisons sont nombreuses. Cette "séquence" d'acides aminés donne des propriétés uniques à chaque protéine. Elle peut par exemple être plutôt hydrophobe (c'est à dire qu'elle a tendance à ne pas aimer se mélanger à l'eau), ou au contraire très hydrophile.

C'est là que j'interviens ! En fonction de la protéine que j'étudie, je vais devoir choisir quelle technique utiliser pour la purifier efficacement et sans l'abîmer. Il existe beaucoup de techniques de purification différentes, mais globalement elles peuvent être regroupées en deux catégories :

• Les techniques permettant de faire "sortir" la protéine de l'organisme et des cellules qui la contiennent (sonication, presse de French, lyse chimique, etc)


• Les techniques permettant d'isoler la protéine d'intérêt parmi le "lysat", c'est à dire le produit de l'étape précédente (chromatographie d'affinité, d'exclusion, échangeuse d'ions, etc)

Pour prendre mon exemple, j'étudie un complexe de protéines d'algue, c'est à dire plusieurs protéines interagissant les unes avec les autres. Je cultive donc mes algues, et suite à ça j'essaie de purifier ce complexe. Pour reprendre les deux types de techniques mentionnées au dessus, voilà à quoi cela ressemble dans mon cas :

• J'utilise dans un premier temps une lyse chimique : je centrifuge mes algues et je les resuspends dans une solution tamponnée contenant des sels, puis je les congèle. Cette simple congélation va déjà commencer à détruire la paroi des cellules d'algue. Ensuite, j'utilise la presse de French : cette technique de lyse physique va créer une différence de pression entre les cellules d'algue et l'extérieur, ce qui va me permettre de récupérer un liquide contenant toutes les protéines de mon algue. Enfin, j'ajoute un détergent à cette solution afin d'extraire le complexe qui m'intéresse (les détergents permettent de récupérer les protèines de type hydrophobe).


• Dans un second temps, je réalise un gradient de densité de sucrose. Cette technique permet de séparer l'ensemble des protéines que j'ai extrait après ajout du détergent en fonction de leur taille. Plus une protéine est grosse, plus elle va se retrouver au fond du tube. J'extrait ensuite mon complexe de protéines, qui apparaît à un certain endroit du tube uniquement. Enfin, je termine ma purification par une chromatographie d'exclusion, qui permet aussi de séparer les protéines en fonction de leur taille, mais de façon plus fine.

Et après ? C'est bon ?

Presque ! On touche au but. Mon complexe de protéines est relativement pur (c'est à dire qu'il n'y a que cette molécule dans ma solution finale). Un seul problème cependant : la concentration est trop faible. Toutes les étapes mentionnées ci-dessus ont certes éliminé les contaminants de ma solution, mais j'ai dû pour ça utiliser plusieurs solutions qui ont dilué mon complexe de protéines. En quoi est-ce un problème ? Et bien par la suite, je veux utiliser cette solution de complexe de protéines pour réaliser des expériences, qui nécessitent que la protéine soit suffisamment présente en solution. Par exemple, j'ai besoin de 4 microlitres de ma solution pour la déposer sur une grille de microscopie, afin de l'observer au microscope. Si ma solution est trop diluée, mes 4 microlitres ne vont contenir qu'un faible nombre de protéines. C'est là qu'interviennent les concentrateurs, le sujet de cet épisode du journal de labo !

Les concentrateurs ?

Les concentrateurs sont des petits dispositifs spécifiques créés pour augmenter la concentration d'une solution de protéines. Comment fonctionnent-ils ? C'est assez simple : un premier tube contenant la solution de protéines est vêtu en son fond d'une membrane laissant passer les molécules d'une certaine taille uniquement. Derrière cette phrase savante se cache un principe très simple : celui de la passoire. Après avoir mis la solution dans la passoire, tous les objets ayant une taille supérieure aux trous restent dans la passoire, alors que le liquide, lui, passe à travers. C'est exactement ce que sont les concentrateurs : des passoires à l'échelle moléculaire. La seule subtilité est qu'il faut utiliser une centrifugeuse pour filtrer la solution, car elle ne coule pas d'elle-même.

Et donc ? Tout va bien non ?

Et bien en principe oui, mais dans la réalité, les concentrateurs ont la fâcheuse réputation de provoquer parfois quelques évènements indésirables. En effet, certaines protéines supportent mal la concentration et s'agrègent durant ce processus, les rendant alors inutilisables et non-fonctionnelles. Aussi, les membranes des concentrateurs ont parfois des interactions avec les protéines, ce qui fait qu'elles peuvent coller à ces dernières, et les retenir durant le processus de concentration.

Vous l'avez deviné, c'est ce qu'il se passe pour mon complexe de protéines. En réalité, après la purification, tout indiquait que mon échantillon était "propre", et que je pouvais l'utiliser pour la suite de mes expériences, et notamment pour la microscopie électronique. Seulement lorsque je regardais mes grilles de microscopie, les protéines que j'observais semblaient anormalement petites par rapport à ce à quoi je m'attendais. Les étapes de purification me laissaient penser que mon complexe de protéines pesait aux alentours de 600 kDa (kDa pour "kiloDalton", unité de mesure du poids des protéines), mais la microscopie montrait des particules bien en deçà de cette mesure.

Pourquoi cet écart inattendu ?

C'est sur ce point précis que j'ai progressé cette semaine : j'ai pu comprendre que l'étape critique qui provoquait ce changement de poids était la concentration. Étant donné que je suspectais depuis quelques semaines que le problème pouvait venir de là, j'ai réalisé une expérience dans laquelle j'ai, après purification, analysé mon complexe de protéines. Je l'ai prélevé avant concentration, pendant, et après. Voici ce que j'ai obtenu :

Sur ce type d'expérience, qu'on appelle gel d'électrophorèse (ou simplement "gel"), on peut observer plusieurs "bandes", organisées en colonne. Chaque colonne est un échantillon différent : si l'on observe plusieurs bandes dans une même colonne, cela signifie qu'il y a plusieurs protéines dans le même échantillon. En plus de ça, la position de la bande (de haut en bas) indique le poids de la protéine. Plus la protéine est lourde, plus elle va être située vers le haut. Sur cette expérience, j'ai déposé des protéines de tailles connues dans la première colonne afin d'avoir une référence : toutes les bandes qui se situent au niveau d'une bande de cet échantillon ont une taille similaire.

Cet expérience montre que pendant le processus de concentration, mon échantillon est très différent. Il a un poids élevé (environ 1000 kDa) avant la concentration, puis contient plusieurs protéines de différentes tailles ensuite, puis durant les cycles suivant de concentration, ces bandes disparaissent pour laisser place à une unique bande aux alentours de 700 kDa. À cet instant, je ne sais pas encore exactement ce qui a pu se passer durant la concentration, mais j'ai pu enfin pointer du doigt le fait que mon complexe de protéines est fortement altéré par le passage dans le concentrateur (ce qui est déjà une information précieuse).

Et maintenant ? Que faire ?

Dans un premier temps, par chance, l'échantillon concentré 3 fois sur le gel montré plus haut semble pur et correspond à la taille d'un complexe de protéines. J'ai pu donc faire des grilles de microscopie avec cet échantillon, et j'espère qu'elles seront concluantes. Pour ce qui est du pourquoi du comment, sachez que rien n'est évident aux premiers abords. On peut résumer de façon simple le changement d'état de mon échantillon (qui est censé être un complexe de protéines) selon le gel pour comprendre ce qui a pu se passer.

Avant concentration, mon échantillon est bon, plutôt pur. Dès lors que je le concentre une première fois, le complexe disparaît pour laisser apparaître plusieurs petites protéines (qui, je pense, composent le complexe initialement). Ensuite, durant le second cycle de concentration, le complexe réapparaît, mais à une taille différente, et les petites protéines disparaissent. Enfin, durant le troisième et dernier cycle, le complexe est plus gros et il n'y a plus de petite protéine. J'ai pensé à plusieurs hypothèses pouvant expliquer cela :

• Première hypothèse : la plus vraisemblable selon moi, mais un peu compliquée. Lors de la concentration, il est possible que les molécules restantes dans le tubes soient organisées différemment dans le liquide et créent des "phases". Ainsi, une partie de la solution peut contenir des complexes de protéines, tandis que l'autre partie contient uniquement des petites protéines résiduelles. Lors du pipettage de la solution, j'ai pu donc pipetter une phase plutôt qu'une autre, ce qui explique les différences entre les pistes sur l'électrophorèse.


• Deuxième hypothèse : la membrane du concentrateur interagit avec le complexe de protéines, provoquant sa dissociation. Cela dit, cette hypothèse n'explique pas pourquoi après 3 cycles de concentration, le complexe est à nouveau là.


• Troisième hypothèse : en cours de chargement (j'ai réalisé cette expérience hier, donc j'y réfléchis toujours !).

C'est tout pour ce premier journal de labo ! J'ai été assez bref sur les notions que je tentais d'introduire, mais il y en a énormément alors je ne voulais pas être trop lourd dès le début. Ça reste quand même un assez gros morceau à lire, donc n'hésitez pas à m'envoyer vos avis dans la section "Contact" du site (je n'ai pas encore codé d'espace commentaires, car c'est assez compliqué !)

À très vite, et merci d'avoir lu !

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